Studie životně důležitých hnědých geopolymerů

Prof. Dr. Christian Steinberg & Dr. Ralph Menzel

1. část – Bezobratlí

Následující pozorování je v rozporu s informacemi z učebnic konvenční toxikologie a ekotoxikologie: zvířata dobrovolně vstupují do stresujícího prostředí, ve kterém jsou nucena přijímat látky, které nemohou využít jako živiny, jako zdroje energie, ani jiným způsobem. Spíše je to dokonce stojí energii, aby tyto látky metabolizovali nebo vylučovali. Použitá energie musí být doplněna zvýšeným příjmem potravy nebo musí být doplněna z jiných běžných procesů, jako je růst nebo množení. Podle současného učení mají tyto látky na zvířata negativní až toxický účinek. (Toxikologie i ekotoxikologie tradičně očekávají negativní účinky na expozici chemickými látkami, a proto raději používají koncentrace, které přehlíží potenciální pozitivní účinky v nízkém koncentračním rozmezí. 

Hlístice jako učitel

Naštěstí zvířata naše knihy nečetla, ale spíše nám ukázala hranice existujícího učení. Otevírají nám oči a vedou nás k novým poznatkům, které se později mohou stát doktrínou. Živočichové, kteří se chovají tak podivně, jsou obyvatelé kompostů, malé hlístice Caenorhabditis elegans, které se snadno kultivují, mají krátký generační cyklus, a proto se používají pro mnoho genetických a molekulárně biologických studií. Tyto pragmatické aspekty byly pro náš výzkum rozhodující.  Abychom provedli podrobné studie o různých účincích huminových látek, využili jsme nejprve tyto a jiné krátkověké živočichy a nikoli poměrně dlouho žijící ryby. Podobné účinky jako u hlístic, lze očekávat i u jiných organismů, zejména vodních živočichů, které jsou v intenzivním kontaktu se svým huminním prostředím – pokud na toto téma někdo provede cílené experimenty. Pojďme se tedy podívat na některé studie o účincích huminových látek na naše hlístice a vodní bezobratlé, než shrneme dříve známé účinky na ryby ve druhé části této řady. Třetí část se nakonec bude zabývat účinky huminových látek na rostliny. Absorpce těchto látek však zůstává před účinkem u zvířat. Na rozdíl od staré doktríny, že huminové látky jsou příliš velké na to, aby byly absorbovány organismy, není pochyb o tom, že jsou absorbovány kůží a / nebo krmivem, a tak se dostávají do těla. Tento biologický nález je nyní také nezávisle potvrzen různými environmentálně – chemickými analýzami, podle kterých mají stavební bloky těchto látek molekulovou velikost, která je v rozsahu průchodnosti membrány. Bylo by zajímavé vidět, jak dlouho potrvá, než stará paradigmata, že huminové látky nemohou procházet membránou, budou odstraněna z příslušných knih.

Pokud jde o přímé účinky těchto látek na zvířata nebo lépe ve zvířatech: ačkoli hlístice (Nematoda) C. elegansbyla v laboratoři šlechtěna po mnoho generací v prostředí bez huminových látek, tato zvířata při našich experimentech aktivně hledala prostředí bohaté na huminové látky. Huminové látky je doslova přitahovaly, což bylo také naznačeno expresí chemosenzorických a čichových genů. Aby se testovala přitažlivost huminových látek, byly dospívající larvy, které byly bezprostředně před adultním stádiem, umístěny na agarové plotny. Na nich umístěná potrava byla namočena v postupně rostoucích koncentracích komerčního huminového přípravku. Po počátečním vyhledávání se 3. den experimentu ukázalo, že červi zřejmě preferují střední koncentrace (5 až 20 mg / l) huminových látek a tam se nejvíce rozmnožují. V předchozích experimentech jsme dokonce zjistili, že huminové látky mají na malé hlístice hormonální účinek, při kterém se vyskytuje převážně zvýšený počet potomků. Tato studie sloužila jako výchozí signál pro naše intenzivní studium huminových látek v jejich fyziologických, biochemických a molekulárně biologických účincích na vodní živočichy. Nejlepší způsob, jak se z těchto příkladů poučit.

Experimenty s rybami, blechami a blešivci jsme věděli, že huminové látky ve vodě, kromě účinku cizího hormonu, u těchto zvířat vedou k řadě stresových reakcí, jako je zvýšení koncentrace stresových proteinů, modulace biotransformačních a antioxidačních enzymů nebo dokonce oxidace membrán a proteinů. Proč však hlístice vykazují toto podivné chování? Proč riskuje, že budou jeho membrány poškozeny stresem? Na první pohled a na základě znalosti z literatury nemá toto chování žádný skutečný účel. Pokud se však podíváte na zvířata v celém jejich životním cyklu, objeví se úžasný výsledek: při tomto zdánlivě absurdním chování červ prodlužuje svůj život. Nyní víme, že mírný chemický stres způsobený přítomností nízkých až středních koncentrací huminových látek vede k významnému prodloužení života. A co víc, červi se stávají odolnějšími vůči mnoha stresorům. K tomuto vedlejšímu účinku se ještě vrátíme.

Nejsou huminy jako huminy

Ne všechny huminové látky fungují stejně, jak jistě každý akvarista už bolestivě zažil: přidání huminových přípravků do akvarijní vody nevedlo k žádoucímu úspěchu anebo naopak způsobilo více problémů. Tento účinek jsme také našli v několika srovnávacích studiích a poté jsme se pokusili pojmenovat určité strukturální prvky pro jednotlivé efekty. Huminové látky lze statisticky popsat pouze s ohledem na jejich chemickou strukturu, protože se jedná o směs látek, které se mění v prostoru i v čase. Jak se říká, jsou to geopolymery, a proto není chemicky tak snadné je charakterizovat jako proteiny, lipidy nebo uhlohydráty.

Za účelem identifikace aktivních struktur v huminových látkách existují dva experimentální způsoby, které se vzájemně nevylučují, ale vzájemně se doplňují:

1. Testujete velké množství huminových látek, jejichž chemické stavební bloky jsou dobře známy, a poté provedete regresní analýzu; člověk proto navazuje takzvaný vztah struktura-účinek. To je samozřejmě velmi náročné na práci a čas.
2. Použijí se jednotlivé složky, které jsou přítomny v huminových látkách – tzv. stavební bloky, nebo se modifikují stávající huminové látky obohacením určitých stavebních bloků. To dává smysl, pokud již máte určité podezření na určité komponenty prostřednictvím zvláštních znalostí.

Modulace růstu Saprolegnia parasitica v závislosti na dva různé isoláty huminových látek (DOC). Horní obrázek: tzv Natural Organic Matter (NOM, z jednoho braniborského jezera izolované pomocí reverzní osmózy). Dolní obrázek: komerční HuminFeed. Černé čtverce – 24 hodinová expozice; bílé kruhy – 48h expozice.

Šli jsme oběma směry s naším “kompostovým červem” a vodními organismy. Ve studii s 20 různými známými humickými látkami jsme se pokusili potlačit nebo dokonce zabít růst mycelia parazitické vodní houby Saprolegnia parasitica – při hledání alternativních terapeutických látek v akvakultuře a akvaristice. 

Ilustrace ukazuje dva protichůdné výsledky s látkami, které jsou souhrnně označovány jako „huminové látky“:

HuminFeed způsobuje měřitelnou inhibici růstu mycelia i při nízkých koncentracích souvisejících s vodou (viz Obrázek), zatímco izolát z jezera Brandenburg dokonce mírně podporoval růst, bez ohledu na to, jak dlouho experiment trval. Aby se zjistilo, zda je možné tento jev zobecnit, zkoumalo se u hlístic C. elegans možné prodloužení životnosti těchto dvou přípravků. Následující obrázek ukazuje překvapující výsledek: HuminFeed má život prodlužující účinek, zatímco v nejlepším případě nemá Brandenburský izolát žádný účinek. Při nejvyšší koncentraci dochází dokonce ke zkrácení života. 

Lze toto zjištění, které bylo získáno u huminových látek, potvrdit druhou výše uvedenou testovací cestou, konkrétně testováním možných stavebních bloků huminové kyseliny?

Dokončená práce se stavebním blokem huminových látek, konkrétně v mnoha rostlinách, ovoci a vínu rozšířený polyfenol quercetin (název pochází z Quercus = dub), ukázala, že tento mírný chemický stres vede nejen k prodloužení životnosti, ale také k odolnosti vůči zvýšeným teplotám a vnějšímu oxidačnímu stresu. Zdá se, že první testovaný přípravek huminové kyseliny měl podobný účinek. Je snadné si představit, že organismy s více odpory jsou dobře vyzbrojeny proti stárnutí, že mohou mírně regulovat stres. Z těchto příkladů je zřejmé, že určité funkční skupiny huminových látek jsou odpovědné za účinky prodlužující život a odolnost vůči stresu. 

Je proto nezbytné se podívat na strukturální návrh týkající se huminových látek. Chemický vzorec znázorněný na obrázku ukazuje složitou strukturu huminové látky v půdě. Ve vodě chybí pevné fáze z hlinitokřemičitanů. 

Z rozsáhlé série testů huminových látek jako terapeutického činidla proti houbě S. parasitica lze destilovat ze vztahu struktura-aktivita, následující tvrzení: Polyfenoly, chinony a stabilní radikály jsou v podstatě zodpovědné za chemický stres a pokud je tento stres mírný – za prodloužení života, zatímco biologicky dostupné aminokyseliny, aminocukry a uhlovodany ne. nebo možná opačný účinek, jmenovitě způsobují zkrácení života. Působí jako bonbóny nebo čokolády a aktivují ty metabolické cesty, které jsou nyní jasně známé pro zkrácení života. Prohlášení týkající se prodloužení života a získání více odporů mohou být potvrzena dalšími závěry analogicky. Analýza genové exprese u C. elegans také ukázala, že byly aktivovány také geny, které jsou specificky zodpovědné za prodloužení života. Patří sem ty, které kódují takzvané stresové proteiny, zejména malé, krystalické a běžné HSP70. Také na proteinové straně byly vždy nalezeny různé složky huminové kyseliny u všech dosud analyzovaných zvířat: u ryb a řady blešivců ze severní polokoule a z jezera Bajkal. Na tuto práci se připravuje vodní plankton. To ukazuje, že jak získání mnohonásobné odolnosti vůči stresu, tak zpomalené stárnutí, jsou spojeny se schopností exprimovat tyto stresové proteiny. K mechanickému potvrzení tohoto tvrzení lze použít studii na ovocných muškách Drosophila melanogaster. V této studii byl divoký kmen a mutant porovnán z hlediska jejich životnosti. Mutant nebyl schopen aktivovat krystalické stresové proteiny a měl pouze asi 2/3 délky života divokých zvířat. Pravděpodobně byla také méně odolná vůči stresorům než ta druhá.

Nativní a tropický vodní zooplankton

Na základě studií hlístic C. elegans jsme rozšířili srovnatelné studie délky života na jiná, relativně krátkověká zvířata. Jako první kandidát byl náš postup podroben u domorodé perloočky velké, Daphnia magna. Tento druh korýše se vyskytuje převážně v malých nádržích a byl již dlouho zaveden jako modelový druh v ekotoxikologických testovacích laboratořích. Za optimálních podmínek sestávají populace pouze ze samic, které se reprodukují parthenogeneticky, tj. samice vždy produkují samice se stejným genetickým uspořádáním. Ve stresových podmínkách se náhle vytvoří samci, kteří se spolu se samičkami spojí, a poté produkují oplodněná trvalá vajíčka. Ty jsou zase schopné diapauzy, což znamená, že mohou přežít špatné podmínky po dlouhou dobu, a pokud se zlepší environmentální faktory za vajíček se vylíhnou opět samí samičky.

Přidání s huminovými látkami bylo takovým stresem v životním prostředí, že samičky najednou produkovaly jen samce. Samci a samice pak byli odděleně vystaveni se zvyšující koncentraci huminové kyseliny – s překvapivým výsledkem: u samic každá vyšší koncentrace látek vede ke zkrácení života a dokonce ke snížení plodnosti. Použité huminové látky byly proto pro samice Daphnia magna jasně toxické. U výrazně kratší životnosti samců však prodlužovali život. 50 % samců žilo až o devět dní déle. Pokud je nám známo, jedná se pouze o druhý důkaz, že chemický stres u bezobratlých vede k změně délky života specifické pro pohlaví. Tato zdánlivě podivná modulace délky života má ekologický smysl. Samice blechy vodní se mohou rozmnožovat až krátce před smrtí, takže mohou také produkovat trvalá vajíčka se samci.

Pokud se prodlouží životnost samců, životní rozpětí má tendenci se synchronizovat, a tím se prodlužuje doba produkce trvalých vajec. A co další vodní členovci, jako je rod Moina? Jak je známo, mnoho druhů tohoto rodu hraje důležitou roli jako krmivo pro mladé ryby v akvaristice a akvakultuře. Pro naše studie mají tyto malé tropické kraby velkou výhodu v tom, že žijí mnohem kratší než naše rodné vodní blechy. Například Moina macrocopa žije pouze tři týdny, pokud je chována za stejných podmínek jako Daphnia magna; za tropických teplot žijí pouze dva týdny. Domorodá perloočka velká na druhé straně zvládla téměř tři měsíce. Měli jsme k dispozici dva druhy Moiny z Brazílie, a to M. macrocopa z louže v Rio de Janeiro a M. micrura z laguny Cabiunas, mělké, s velmi huminovou vodou v národním parku Restinga de Jurubatiba v blízkosti ropného města Macae, 180 km východně od Rio de Janeiro. M. micrura je zjevně tvor milující huminové látky, protože tento druh odmítl růst v laboratoři, pokud kultivační roztok neobsahoval žádné huminové látky. Spíše přidání huminových látek z laguny Atoleiro (také umístěných v národním parku Restinga de Jurubatiba a s více než 200 mg / l DOC, pokud víme, povrchové vody s nejvyšším obsahem huminovych látek na světě) zvýšilo rychlost reprodukce až do koncentrace 50 mg / l DOC. Již tato koncentrace přesahuje všechny hodnoty známé z Evropy. Až 100 mg / l DOC z laguny Atoleiro mělo inhibiční účinek. Naše pracovní hypotéza, která je přezkoumávána v probíhající disertační práci v Rio de Janeiro, je taková, že kromě tohoto hormonu podobného účinku se u těchto blech vody v polyhumusních pobřežních lagunách objevila i vícenásobná odolnost proti stresu. Zejména organismy v těchto lagunách by se měly stát odolnými vůči soli a souvisejícím osmotickým stresovým situacím, protože Atlantický oceán během bouří občas vniká do těchto vod. Druh Moina z Rio de Janeiro rostl bez huminových látek, ale žil mnohem déle, když byla voda zbarvena do hnědá až do černá. Netoleroval však tak vysoké koncentrace jako jeho příbuzní z laguny s černou vodou. Přesto se vyznačuje chováním podezřelým pro zápis do knihy rekordů: s huminovými látkami bylo možné prodloužit jejich život až o 60 procent, což nebylo dříve známo z chemického podnětu ve výzkumu stárnutí.

Jsou ryby jen větší červi?

Co je tedy známo o účinku huminových látek na ryby nebo v rybách? Jsou ryby jen větší červi? Ve skutečnosti v tomto ohledu nejsou ničím víc než většími červy – i když akvaristé to neradi uslyší. Za prvé, žijí výrazně déle než náš „šílený červ“ nebo tropický zooplankton, takže neexistují odpovídající celoživotní studie s huminovými látkami. Bylo by představitelné s africkým halančíkem Nothobranchia furzeri, který celý svůj životní cyklus dokončí za pouhých dvanáct týdnů, aby přežil období sucha v savaně jako oplodněné vajíčko. Díky tomu je jeho životnost srovnatelná s životem naší Perloočky velké. Vědci studující stárnutí, kteří vždy hledali přesvědčivá modelová zvířata, objevili tohoto krátce žijícího obratlovce pro své účely a už ho použili. Koneckonců, tablety proti stárnutí jsou pro kupujícího atraktivnější, pokud balíček říká „Úspěšně testováno na obratlovcích XYZ“ místo „Prodloužilo životnost červů ABC“. A hle: dokonce i obratlovce s podivným druhovým názvem je velmi pozitivně ovlivněn stavebními bloky huminových látek. Například italská pracovní skupina úspěšně testovala resveratrol, polyfenol, který se nachází v mnoha druzích ovoce a v olivovém oleji: ryby žily o dva týdny déle. Můžeme tedy s určitým odůvodněním předpokládat, že mnoho výše popsaných mechanismů na červa a zooplankton, například získání vícenásobné odolnosti vůči stresu, se bude vztahovat na ryby tímto nebo podobným způsobem.