Huminové látky – mrtvý, vysoce aktivní materiál

Huminové látky mohou výrazně ovlivňovat životní procesy vodních organismů, jejich účinky však závisí na typu látky, koncentraci i samotném organismu. Christian Steinberg a Ralph Menzel v první části své studie popisují experimenty s hlísticemi a vodními bezobratlými, které ukazují souvislosti mezi mírným chemickým stresem, odolností organismů a délkou života.

Studie životně důležitých hnědých geopolymerů

Prof. Dr. Christian Steinberg & Dr. Ralph Menzel

1. část – Bezobratlí

Následující pozorování je v rozporu s údaji v učebnicích konvenční toxikologie a ekotoxikologie: živočichové dobrovolně vstupují do stresujícího prostředí, v němž jsou nuceni přijímat látky, které nemohou využít jako živiny, zdroje energie ani jiným způsobem. Jejich metabolizace nebo vylučování je naopak stojí energii. Tato energie musí být doplněna zvýšeným příjmem potravy nebo odebrána jiným běžným procesům, jako jsou růst či rozmnožování. Podle současného učení mají tyto látky na živočichy negativní až toxický účinek. Toxikologie i ekotoxikologie tradičně očekávají negativní účinky expozice chemickým látkám, a proto přednostně používají koncentrace, které mohou přehlédnout potenciální pozitivní účinky v nízkém koncentračním rozmezí.

Hlístice jako učitel

Naštěstí zvířata naše knihy nečetla, ale ukázala nám hranice dosavadního učení. Otevírají nám oči a vedou nás k novým poznatkům, které se později mohou stát součástí nauky. Těmito neobvykle se chovajícími živočichy jsou malé hlístice Caenorhabditis elegans, obyvatelé kompostu, které lze snadno kultivovat a které mají krátký generační cyklus. Proto se používají v mnoha genetických a molekulárněbiologických studiích. Tyto praktické vlastnosti byly pro náš výzkum rozhodující.

Pro podrobné studium různých účinků huminových látek jsme proto nejprve využili tyto a další krátkověké živočichy, nikoli poměrně dlouho žijící ryby. Podobné účinky jako u hlístic lze očekávat také u jiných organismů, zejména vodních živočichů, kteří jsou v intenzivním kontaktu s prostředím obsahujícím huminové látky – pokud někdo na toto téma provede cílené experimenty. Podívejme se tedy nejprve na některé studie účinků huminových látek na hlístice a vodní bezobratlé, než ve druhé části této série shrneme dříve známé účinky na ryby.

Aby látky mohly v organismu působit, musí je živočich nejprve přijmout. Na rozdíl od starší představy, že huminové látky jsou příliš velké na to, aby je organismy absorbovaly, dnes není pochyb o tom, že se přijímají kůží a/nebo potravou, a tak se dostávají do těla. Tento biologický nález nyní nezávisle potvrzují také různé environmentálněchemické analýzy, podle nichž mají stavební složky těchto látek molekulovou velikost v rozsahu propustnosti membrán. Bylo by zajímavé sledovat, jak dlouho potrvá, než bude staré paradigma o neprostupnosti huminových látek přes membrány odstraněno z příslušných učebnic.

Pokud jde o přímé účinky těchto látek na živočichy, či přesněji v jejich tělech: ačkoli byla hlístice C. elegans v laboratoři po mnoho generací chována v prostředí bez huminových látek, při našich experimentech aktivně vyhledávala prostředí bohaté na tyto látky. Huminové látky ji doslova přitahovaly, což naznačovala také exprese chemosenzorických a čichových genů. K testování této přitažlivosti byly dospívající larvy bezprostředně před dospělým stadiem umístěny na agarové plotny. Potrava na plotnách byla napuštěna postupně rostoucími koncentracemi komerčního huminového přípravku.

Třetí den experimentu se po počátečním vyhledávání ukázalo, že červi zřejmě preferují střední koncentrace huminových látek (5–20 mg/l) a nejvíce se při nich rozmnožují. V předchozích experimentech jsme dokonce zjistili, že huminové látky mají na malé hlístice hormonální účinek, který se projevuje převážně zvýšeným počtem potomků. Tato studie se stala výchozím impulzem pro naše intenzivní studium fyziologických, biochemických a molekulárněbiologických účinků huminových látek na vodní živočichy. Z těchto příkladů se lze učit nejlépe.

Z experimentů s rybami, perloočkami a blešivci jsme věděli, že huminové látky ve vodě vedou u těchto živočichů kromě účinku podobného cizorodým hormonům k řadě stresových reakcí. Patří mezi ně zvýšení koncentrace stresových proteinů, modulace biotransformačních a antioxidačních enzymů nebo dokonce oxidace membrán a proteinů.

Proč však hlístice vykazují toto neobvyklé chování? Proč riskují poškození svých membrán stresem? Na první pohled a podle poznatků z literatury nemá takové chování zřejmý účel. Pokud však sledujeme živočichy po celý jejich životní cyklus, objeví se překvapivý výsledek: tímto zdánlivě nesmyslným chováním si červ prodlužuje život. Nyní víme, že mírný chemický stres způsobený nízkými až středními koncentracemi huminových látek vede k významnému prodloužení života. Červi se navíc stávají odolnějšími vůči mnoha stresorům. K tomuto doprovodnému účinku se ještě vrátíme.

Nejsou huminy jako huminy

Ne všechny huminové látky působí stejně, jak už jistě bolestivě zjistil nejeden akvarista: přidání huminových přípravků do akvarijní vody nepřineslo žádoucí výsledek, nebo naopak způsobilo další problémy. Tento rozdílný účinek jsme zaznamenali také v několika srovnávacích studiích a následně jsme se pokusili určit strukturní prvky odpovědné za jednotlivé účinky. Huminové látky lze z hlediska chemické struktury popsat pouze statisticky, protože jde o směsi látek, které se mění v prostoru i čase. Jsou to takzvané geopolymery, a proto je nelze chemicky charakterizovat tak snadno jako proteiny, lipidy nebo sacharidy.

K identifikaci aktivních struktur v huminových látkách lze využít dva experimentální přístupy, které se nevylučují, ale vzájemně se doplňují:

1. Otestuje se velké množství huminových látek, jejichž chemické stavební složky jsou dobře známy, a následně se provede regresní analýza. Tím se stanoví takzvaný vztah struktura–účinek. Tento postup je samozřejmě velmi pracný a časově náročný.
2. Použijí se jednotlivé složky přítomné v huminových látkách, tedy takzvané stavební bloky, nebo se stávající huminové látky upraví obohacením o určité stavební bloky. Tento postup dává smysl, pokud již na základě specifických znalostí existuje podezření na určité složky.

Modulace růstu Saprolegnia parasitica v závislosti na dvou různých izolátech huminových látek (DOC). Horní obrázek: takzvaná Natural Organic Matter (NOM), izolovaná reverzní osmózou z braniborského jezera. Dolní obrázek: komerční přípravek HuminFeed. Černé čtverce – expozice po dobu 24 hodin; bílé kruhy – expozice po dobu 48 hodin.

Oba přístupy jsme použili při pokusech s naším „kompostovým červem“ i s vodními organismy. Ve studii s 20 různými známými huminovými látkami jsme se při hledání alternativních terapeutických látek pro akvakulturu a akvaristiku pokusili potlačit, nebo dokonce zastavit růst mycelia parazitické vodní houby Saprolegnia parasitica.

Ilustrace ukazuje dva protichůdné výsledky s látkami, které jsou souhrnně označovány jako „huminové látky“:

HuminFeed měřitelně potlačuje růst mycelia již při nízkých koncentracích ve vodě (viz obrázek), zatímco izolát z braniborského jezera růst dokonce mírně podporoval bez ohledu na délku experimentu. Abychom zjistili, zda lze tento jev zobecnit, zkoumali jsme u hlístic C. elegans možné prodloužení života působením těchto dvou přípravků. Následující obrázek ukazuje překvapivý výsledek: HuminFeed život prodlužuje, zatímco braniborský izolát nemá v nejlepším případě žádný účinek. Při nejvyšší koncentraci dochází dokonce ke zkrácení života.

Lze toto zjištění, které bylo získáno u huminových látek, potvrdit druhou výše uvedenou testovací cestou, konkrétně testováním možných stavebních bloků huminové kyseliny?

Dokončená práce se stavebním blokem huminových látek, polyfenolem kvercetinem rozšířeným v mnoha rostlinách, plodech a víně (název pochází z latinského Quercus = dub), ukázala, že tento mírný chemický stres vede nejen k prodloužení života, ale také k odolnosti vůči zvýšeným teplotám a vnějšímu oxidačnímu stresu. Zdá se, že podobně působil také první testovaný přípravek huminové kyseliny.

Lze si představit, že organismy s vícenásobnou odolností vůči stresu jsou proti stárnutí dobře vybaveny, protože dokážou mírný stres regulovat. Z těchto příkladů vyplývá, že určité funkční skupiny huminových látek odpovídají za účinky prodlužující život a zvyšující odolnost vůči stresu.

Je proto nezbytné zaměřit se na strukturu huminových látek. Chemický vzorec znázorněný na obrázku ukazuje složitou strukturu huminové látky v půdě. Ve vodě chybějí pevné fáze tvořené hlinitokřemičitany.

Z rozsáhlé série testů huminových látek jako terapeutického prostředku proti houbě S. parasitica lze ze vztahu struktura–aktivita odvodit následující tvrzení: za chemický stres a při jeho mírné intenzitě také za prodloužení života odpovídají především polyfenoly, chinony a stabilní radikály. Biologicky dostupné aminokyseliny, aminocukry a sacharidy tento účinek nemají, nebo mohou působit opačně a život zkracovat. Působí podobně jako sladkosti a aktivují metabolické dráhy, o nichž je dnes známo, že délku života zkracují.

Tvrzení o prodloužení života a získání vícenásobné odolnosti vůči stresu podporují také další nálezy. Analýza genové exprese u C. elegans ukázala aktivaci genů specificky spojených s prodloužením života. Patří mezi ně geny kódující takzvané stresové proteiny, zejména malé krystaliny a běžný HSP70. Také na úrovni proteinů byly u všech dosud analyzovaných živočichů – ryb a řady blešivců ze severní polokoule i z jezera Bajkal – vždy nalezeny různé složky huminové kyseliny. Připravuje se obdobná práce s vodním planktonem.

To ukazuje, že získání vícenásobné odolnosti vůči stresu i zpomalené stárnutí souvisejí se schopností exprimovat tyto stresové proteiny. Mechanistickou podporu tohoto tvrzení poskytuje studie octomilek Drosophila melanogaster. V ní byly z hlediska délky života porovnány divoký kmen a mutant. Mutant nedokázal aktivovat krystalinové stresové proteiny a dosahoval pouze přibližně 2/3 délky života divokého kmene. Pravděpodobně byl také méně odolný vůči stresorům.

Nativní a tropický vodní zooplankton

Na základě studií hlístic C. elegans jsme rozšířili srovnatelné studie délky života na další relativně krátkověké živočichy. Prvním kandidátem byla původní perloočka velká, Daphnia magna. Tento korýš se vyskytuje převážně v malých vodních nádržích a již dlouho slouží jako modelový druh v ekotoxikologických testovacích laboratořích.

Za optimálních podmínek tvoří populace pouze samice, které se rozmnožují partenogeneticky; samice tedy produkují další samice se stejnou genetickou výbavou. Ve stresových podmínkách se náhle objevují samci, kteří se páří se samicemi, a následně vznikají oplozená trvalá vajíčka. Ta jsou schopna diapauzy, takže mohou dlouhodobě přežít nepříznivé podmínky. Jakmile se podmínky prostředí zlepší, z vajíček se opět líhnou samice.

Přidání huminových látek představovalo tak výrazný stres prostředí, že samice náhle produkovaly pouze samce. Obě skupiny pak byly odděleně vystaveny rostoucím koncentracím huminové kyseliny – s překvapivým výsledkem: u samic každé zvýšení koncentrace vedlo ke zkrácení života, a dokonce ke snížení plodnosti. Použité huminové látky tedy byly pro samice Daphnia magna jednoznačně toxické. Samcům, jejichž délka života je výrazně kratší, však život prodlužovaly. 50 % samců žilo až o devět dní déle.

Pokud je nám známo, jde teprve o druhý doklad toho, že chemický stres u bezobratlých vyvolává změnu délky života specifickou pro pohlaví. Tato zdánlivě neobvyklá modulace délky života má ekologický smysl. Samice perlooček se mohou rozmnožovat až krátce před smrtí, a mohou tedy se samci vytvářet trvalá vajíčka.

Prodlouží-li se život samců, délka života obou pohlaví se může více překrývat, a tím se prodlužuje období tvorby trvalých vajíček.

A co další vodní členovci, například rod Moina? Mnoho druhů tohoto rodu hraje důležitou roli jako krmivo pro mladé ryby v akvaristice a akvakultuře. Pro naše studie mají tito drobní tropičtí korýši velkou výhodu: žijí podstatně kratší dobu než naše původní perloočky. Například Moina macrocopa žije při stejných podmínkách chovu jako Daphnia magna pouze tři týdny; při tropických teplotách jen dva týdny. Naproti tomu původní perloočka velká dosahovala téměř tří měsíců.

Měli jsme k dispozici dva druhy rodu Moina z Brazílie: M. macrocopa z louže v Riu de Janeiru a M. micrura z laguny Cabiúnas, mělké vody s vysokým obsahem huminových látek v národním parku Restinga de Jurubatiba poblíž ropného města Macaé, 180 km východně od Ria de Janeira.

M. micrura je zjevně organismem vyžadujícím huminové látky, protože v laboratoři nerostla, pokud je kultivační roztok neobsahoval. Přidání huminových látek z laguny Atoleiro, která se rovněž nachází v národním parku Restinga de Jurubatiba a s více než 200 mg/l DOC představuje podle našich znalostí povrchovou vodu s nejvyšším obsahem huminových látek na světě, zvýšilo rychlost rozmnožování až do koncentrace 50 mg/l DOC. Již tato koncentrace překračuje všechny hodnoty známé z Evropy. Koncentrace 100 mg/l DOC z laguny Atoleiro již působila inhibičně.

Naší pracovní hypotézou, prověřovanou v probíhající disertační práci v Riu de Janeiru, je, že se u těchto perlooček z polyhumózních pobřežních lagun kromě účinku podobného hormonálnímu působení vyvinula také vícenásobná odolnost vůči stresu. Organismy v těchto lagunách by měly být odolné zejména vůči soli a souvisejícímu osmotickému stresu, protože při bouřích do těchto vod občas proniká Atlantický oceán.

Druh rodu Moina z Ria de Janeira rostl i bez huminových látek, ale žil mnohem déle, když byla voda zbarvena hnědě až černě. Netoleroval však tak vysoké koncentrace jako jeho příbuzný z černovodní laguny. Přesto vykázal výsledek hodný zápisu do knihy rekordů: působením huminových látek bylo možné prodloužit jeho život až o 60 procent, což u chemického podnětu nebylo ve výzkumu stárnutí dříve známo.

Jsou ryby jen větší červi?

Co je tedy známo o účinku huminových látek na ryby či v jejich organismu? Jsou ryby jen větší červi? V tomto ohledu se skutečně chovají jako větší červi – i když to akvaristé možná neradi uslyší. Především žijí výrazně déle než náš „šílený červ“ nebo tropický zooplankton, takže odpovídající celoživotní studie s huminovými látkami nejsou k dispozici.

Takovou studii by si bylo možné představit u afrického halančíka Nothobranchius furzeri, který dokončí celý životní cyklus za pouhých dvanáct týdnů a období sucha v savaně přežívá jako oplozené vajíčko. Jeho délka života je proto srovnatelná s perloočkou velkou. Vědci zabývající se stárnutím, kteří stále hledají vhodné modelové organismy, tohoto krátkověkého obratlovce již objevili a použili. Ostatně přípravek proti stárnutí je pro zákazníka přitažlivější, pokud se na obalu píše „Úspěšně testováno na obratlovci XYZ“ namísto „Prodloužilo život červa ABC“.

A skutečně: i tohoto obratlovce s neobvyklým druhovým názvem velmi příznivě ovlivňují stavební složky huminových látek. Italská pracovní skupina například úspěšně testovala resveratrol, polyfenol obsažený v mnoha druzích ovoce a v olivovém oleji: ryby žily o dva týdny déle. Lze tedy s určitým odůvodněním předpokládat, že mnohé z mechanismů popsaných výše u červů a zooplanktonu, například získání vícenásobné odolnosti vůči stresu, se stejným nebo podobným způsobem uplatňují také u ryb.

Pokračování: Huminové látky – abiotický vysoce aktivní materiál

Překlad: Kersten Opitz
Publikováno: 2.11.2020