Huminové látky – abiotický vysoce aktivní materiál

Huminové látky ovlivňují řadu biologických procesů u ryb a dalších vodních organismů. Christian Steinberg a Ralph Menzel shrnují výsledky studií zaměřených na odolnost vůči stresu, vývoj, hormonální působení, hospodaření s ionty i vztah huminových látek k infekcím. Výsledky zároveň ukazují, že jejich účinky závisí na typu a koncentraci huminových látek a že vysoké koncentrace mohou být toxické.

Studie životně důležitých hnědých geopolymerů 

Prof. Dr. Christian Steinberg & Dr. Ralph Menzel 

2. Ryby

Dva týdny stresu po odchytu do síťky

V první části naší série o huminových látkách v akváriích jsme uvedli, že vyvolávají chemický stres, který však má pozitivní účinek, pokud není příliš silný. Tato zjištění byla získána zejména u hlístic Caenorhabditis elegans. Zvířata ošetřená huminovými látkami získávají vícenásobnou odolnost proti stresu a díky tomu žijí déle než jedinci, kteří tomuto stresu nebyli vystaveni. Viděli jsme také, že ryby se v tomto ohledu chovají jako červi, protože krátce žijící druh halančíků Nothobranchius furzeri reagoval na pobyt v roztoku huminových látek rovněž prodloužením života. Kromě této studie ještě nejsou k dispozici srovnatelné, podrobné a specifické studie o mechanismech životního cyklu u ryb. Nicméně s dnešními znalostmi lze naše starší studie ryb lépe interpretovat. Při časově náročném zkoumání mečovek, Xiphophorus helleri, jsme zjistili vznik zjevné (vícenásobné) odolnosti vůči mechanickým stresorům. Během dvou týdnů byly mladé ryby vyloveny z akvárií pomocí sítěk a vloženy do akvárií s čerstvou vodou. Následný vývoj hmotnosti u zvířat v kontrolní skupině téměř stagnoval, zatímco zvířata přemístěná do vody s velmi nízkými koncentracemi huminových látek se okamžitě zotavila a pokračovala v růstu, jako by žádný stres neexistoval. Tento jev lze vysvětlit pouze skutečností, že mladé mečovky vyvinuly odolnost vůči komplexním stresorům prostřednictvím chemických stimulů zprostředkovaných huminovými látkami, tj. vícenásobnou odolností vůči stresu. Další studie s parametry biochemického stresu, jako je koncentrace kortizolu, nyní ukázala, že kapr, Cyprinus carpio, se může lépe vyrovnat s tepelným stresem, pokud jsou ve vodě přítomny huminové látky. Tento účinek snižující stres však nebyl pozorován u všech huminových látek. Stále ještě nevíme, zda stres potlačují stejné aktivní látky, které prodloužují život. Huminové látky mají také pozitivní vliv na individuální vývoj ryb. Testovali jsme to s oplozenými jikrami Danio rerio. Vzhledem k velké variabilitě v přežití jiker těchto ryb nebylo dosaženo statisticky spolehlivých výsledků; existuje však tendence, že nízké koncentrace mají příznivý účinek, zatímco vysoké koncentrace jsou jasně toxické. Toxické účinky huminových přípravků byly také pozorovány na embryích dánií a na rybách v australských řekách, když byly zjištěny vysoké koncentrace výluhů eukalyptu. Jako potvrzení výše uvedených výsledků s Danio rerio ve volné přírodě lze vyhodnotit výsledky z jezer kanadského štítu. Kanadští autoři zjistili, že úspěšnost líhnutí a výskyt okouna žlutého, Perca flavescens, byly zvláště dobré, když koncentrace huminových látek v jezeře byly zvláště vysoké v důsledku těžby dřeva v povodí.

Huminové látky mají estrogenní potenciál

Pokud se podíváte na staré publikace o huminových látkách, které popisují lékařskou aplikaci, opakovaně narazíte na náznak, že tyto látky mají feminizující, tedy estrogenní účinek. Z dnešního pohledu byly příslušné testy prováděny s použitím relativně drsných metod (otok vaginální sliznice u samic potkanů). Byly také pozorovány v uzavřených oběhových systémech v akvakultuře, ve kterých, jak je známo, se v průběhu času hromadily látky podobné huminovým látkám, takže z oplodněných jiker se vyvinuly výhradně samičky. Bylo to jen nesystematické individuální pozorování nebo je za tím opravdu více?

Odpověď na otázku je jednoznačně pozitivní: huminové látky mají estrogenní potenciál, a tedy feminizující účinek na oplozené rybí jikry a vajíčka obojživelníků. Abychom to zkontrolovali a abychom se vyhnuli možné kontaminaci huminovými látkami ve vodě samičími hormony, použili jsme syntetické huminové látky pro testy s čerstvě narozenými mladými mečovkami Xiphophorus helleri a s drápatkami Xenopus laevis. Jak je známo, pohlaví mnoha nižších obratlovců není geneticky fixováno, ale pohlaví určují vnější faktory, jako je teplota, nepříznivé poměry pohlaví nebo chemické podmínky. Dokonce i dospělé mečovky mohou změnit své pohlaví. Takže tyto ryby byly našimi prvními testovacími kandidáty. Ve skutečnosti zvyšující se koncentrace huminových látek způsobují snížení podílu samců u juvenilních ryb. Tento přístup byl později zopakován s drápatkami. Výsledek byl podobný. Protože je Xenopus laevis velmi dobře zkoumána v molekulární biologii, úspěšně jsme také hledali tzv. informační RNA (messenger RNA, mRNA) estrogenového receptoru, což znamená, že huminové látky interagují s genetickým materiálem v buněčném jádru a uvolňují signály pro produkci ženských hormonů nebo žloutkového proteinu. Žloutkový protein se odborně nazývá „vitellogenin“ a ve skutečnosti se produkuje pouze samičími rybami, aby se vyvíjejícím embryím zajistily živiny. V průběhu výzkumu chemických látek s cizím hormonálním účinkem ve vodě byla u mladých rybích samců zjištěna produkce vitellogeninu – jasný znak feminizace, protože protein vaječného žloutku by měly syntetizovat pouze samice. Nejjednodušší způsob, jak to ověřit, je použít hlístici C. elegans, jejíž mRNA pro vitellogenin je dobře známa. V důsledku toho náš tým testoval huminové látky na jejich estrogenový potenciál, hledal tuto mRNA – a skutečně ji prokázal, jak je vidět na přiloženém obrázku. Ačkoli v současnosti nedokážeme říci, co tyto nálezy znamenají na úrovni populace v ekosystému, je třeba poznamenat, že pozorování uvedená v uzavřených akvakulturních zařízeních rozhodně nejsou artefakty: huminové látky mají zjevně estrogenový potenciál.

Život ryb v černé vodě je možný pouze s huminovými látkami

Ekofyziologickou a evolučněbiologickou otázkou, která zaměstnává vědce, je, jak ryby dokáží existovat v kyselých vodách chudých na minerály, jako je Rio Negro, v lagunách v národním parku Restinga de Jurubatiba nebo ve stanovištích mnoha labyrintních ryb v jihovýchodní Asii. Jak přijímají malé množství základních iontů z vody a poté zabraňují jejich uvolňování z těla? Při pH 3–4 by se kosti měly rozpouštět a neměly by se vytvářet, jak je známo z výzkumu acidifikace vody pomocí kyselých depozit nebo těžby. Brazilská pracovní skupina právě vydala studii objasňující toto téma. Tým dochází k závěru, že huminové látky zlepšují vstřebávání iontů a snižují jejich uvolňování z ryb. Zdá se, že tyto procesy jsou odlišné pro sodné a vápenaté ionty. U vápníku byl zjištěn významně zvýšený příjem, když byly v roztoku huminové látky. To, zda bylo pH kolem 3 nebo kolem neutrálního bodu, hrálo velmi malou roli. Kromě toho se zdá, že u neonek červených Paracheirodon axelrodi bylo více potlačeno vylučování sodíku než vápníku, což u těchto teter podporovalo samoregulaci. V této práci byl diskutován následující mechanismus pro zvýšení absorpce životně důležitých základních kationtů:

Agregáty huminové kyseliny s bazickými kationty se ukládají na žábry a tímto způsobem kationty koncentrují. Již nejsou přes žábry absorbovány proti gradientům tak silným, jako by kationty byly v čistém roztoku. Jak se však omezuje nebo zabraňuje úbytku kationtů z tělesných tkání ryb? Zdá se, že diskutované mechanismy nejsou zcela přesvědčivé ani pro příjem, ani pro omezené vylučování. Určitě musí existovat i jiné mechanismy. Vysvětlení opět nabízejí naše pokusy s hlísticí. Celková genomická analýza hlístice C. elegans, kterou jsme vystavili dvě různé huminové látky, ukázala, že přinejmenším u tohoto živočicha existují ještě další mechanismy příjmu. Aktivovaly se geny odpovědné za tzv. iontové kanály. Posledně jmenované jsou proteiny v membránách, které pumpují anorganické ionty (jako jsou ionty sodíku a vápníku) do vnitřku buňky. Kromě toho naše hlístice aktivovala geny, které kódují absorpci organických iontů. Tyto „nosiče organických kyselin“ jsou nespecifické, takže si můžeme dobře představit, že se těmito cestami mohou absorbovat i malé komplexy huminových látek se zásaditými kationty. Nedávno jsme také zjistili například na různonožcích, že huminové látky mohou blokovat i jiné takzvané exportéry. Tyto „exportéry“ jsou proteiny vázané na membránu, které čerpají různé produkty rozkladu a cizí látky z buněk, takže tam nemají žádné škodlivé účinky. Jejich zablokování znamená, že jakmile se látky absorbují, zůstávají v buňkách. Jsme si jisti, že toto zjištění platí také pro exportéry, kteří se podílejí na regulaci anorganických iontů (tzv. iontové kanály). Jakmile se životu důležité ionty absorbují, zůstávají v buňkách.

Co ještě způsobují huminové látky rybám

Při hledání účinných alternativ k silným chemickým terapeutickým látkám v akvakultuře, které způsobují mnoho vedlejších účinků, byly mnohokrát testovány přírodní a uměle vyráběné huminové látky. Je proto již nějakou dobu známo, že huminové látky mají četné přímé a nepřímé účinky na ryby. Jak je obvyklé v čistě aplikačně orientovaném výzkumu, mnohá pozorování zůstávají povrchní a často byla také publikována v těžko přístupných publikacích, jako jsou interní zprávy z výzkumných institucí. Nicméně ve světle výše popsaných mechanistických studií s hlísticemi C. elegans se nyní jeví jako důvěryhodná a zaslouží si být zpřístupněna. Bylo známo, že huminové látky posilují imunitní systém aktivací bílých krvinek a vedou k dalším obranným mechanismům. Také chrání pokožku nebo iniciují tvorbu nových membrán díky vysrážení proteinů. Takové membrány se nacházejí na sliznicích a mají protizánětlivé, drenážní účinky a/nebo podporují srážení krve. Je snadné si představit, že ryby se zdravou kůží jsou odolnější vůči pronikání a růstu parazitických hub, které se nacházejí všude. Než se zjistilo a následně postupně přijalo, že organismy mohou huminové látky přijímat a že tyto látky v nich vyvolávají různé vnitřní reakce, připisovaly se pozorované pozitivní a posilující účinky expozice těmto látkám v akvaristice a akvakultuře nepřímým účinkům. Hlavní nepřímé účinky se týkají interakce patogenů a parazitů s rybami. Patogeny a parazité jsou všude. Ve volné přírodě se zdravá ryba vyznačuje velkou rozmanitostí parazitů, které se však vyskytují pouze při nízkých individuálních hustotách. Za nepříznivých podmínek prostředí se diverzita parazitů snižuje, ale hustota jedinců zbývajících druhů parazitů se drasticky zvyšuje. Kromě toho mohou stresující situace, které ovlivňují ryby, posunout rovnováhu mezi hostiteli a parazity ve prospěch parazitů. Existuje jen několik, navíc rozporuplných zpráv o tom, zda huminové látky mohou bránit rozvoji patogenních bakterií a jednobuněčných organismů. Možným mechanismem pro jejich inhibici je uvolňování reaktivních forem kyslíku z exponovaných huminových látek. Obecně jsou tyto jednobuněčné organismy mnohem citlivější než ryby. Podobný mechanismus se může vztahovat také na patogeny, které pronikly do organismu, protože jak proniklé patogeny, tak i přijímané huminové látky vedou k vnitřní aktivaci kyslíku. Vzniká tzv. oxidační stres, který poškozuje patogeny více než hostitele. Oslabená hostitelská zvířata jsou preferována parazity. Těch několik dostupných zpráv o vlivu huminových látek na nepříjemné hosty si navzájem protiřečí pravděpodobně proto, že byly provedeny experimenty s různými huminovými látkami. Tyto zprávy bohužel nedostatečně charakterizují huminové látky, které byly použity, aby to bylo možné posoudit. Za účelem odstranění tohoto nedostatku byly nedávno provedeny dvě rozsáhlé studie o účinku huminových látek na infekci zlatých rybek Carassius auratus plísní Saprolegnia parasitica a jejím růstem mycelia. Nemocné ryby byly ošetřovány huminovým roztokem (HS1500) po dobu jedné a půl až dvou hodin denně. 16 % zemřelo v kontrolní skupině a pouze 8 % v ošetřené skupině. U léčených zvířat zmizely sekundární infekce Saprolegnia parasitica a léze a záněty se rychle zahojily.

Ve výše uvedené druhé studii bylo testováno 20 velmi odlišných huminových látek a jejich účinek na růst mycelia. Huminové látky v ekologicky realistických koncentracích až na několik výjimek zabránily vegetativnímu růstu této houby. Tvorbě spor však nezabránily. Houby přecházejí do klidové fáze, která může přežít nepříznivé podmínky prostředí. Zdá se, že za inhibiční účinky odpovídají zralejší huminové látky ve vyšších koncentracích, zatímco struktury, které lze snadno použít, jako jsou aminokyseliny a uhlohydráty, mají tendenci podporovat vegetativní růst. Celkově huminové látky nemohou zcela zabránit růstu a virulenci S. parasitica, ale zdá se, že významně zmírňují infekci a urychlují hojení.

Co z toho plyne pro akvaristy?

Z těchto výsledků vyplývá pro péči a chov citlivých ryb z černých vod následující: Dokud nelze určité strukturní prvky pojmenovat pro jednotlivé účinky huminových látek, neměli bychom experimentovat s huminovými látkami neznámých vlastností, ale nadále používat recepty získané letitými empirickými zkušenostmi. Tato situace se také moc rychle nezmění, protože huminové látky jsou tzv. geopolymery. To znamená, že se jejich specifické složení mění místo od místa, a i na jednom místě podle sezóny. Aby bylo možné připsat účinky určitým vlastnostem, je zapotřebí velké množství experimentů s různými huminovými izoláty, aby bylo možné zjistit vztah mezi strukturou a účinkem. Jehličí ani eukalyptus se kvůli známým inhibičním účinkům nedoporučují. (Varování před eukalyptem může zpočátku znít exoticky. Tyto stromy rostou v lesích po celém světě a poté, co dobyly mnoho tropických zemí, jsou na postupu zejména v jižní Evropě.) Čerstvě spadané listí může být pro vodní živočichy problematické kvůli vysokému obsahu snadno dostupných proteinů a uhlohydrátů. Jediným doporučením je tedy použít staré listy ze země. Podle našich zkušeností mají tyto listy nízký obsah biologicky dostupných bílkovin a sacharidů a jsou výrazně reaktivnější než čerstvé.

Dalším nebezpečím je někdy předávkování huminovými látkami. Ukázali jsme pomocí různých příkladů, že zejména nízké a střední koncentrace způsobují pozitivní účinky, jako je prodloužení života nebo odolnost vůči stresu. Naproti tomu vysoké koncentrace jsou často toxické pro reprodukci nebo dokonce život ohrožující. Z toho vyplývá, že huminové látky se nemají předávkovávat, chceme-li rybám dlouhodobě zajistit dobré podmínky. Existuje však skutečně riziko předávkování v akváriích? Koncentrace, které způsobily negativní toxické účinky v našich pokusech, byly tak vysoké, že úplně znemožnily pohled na ryby v akváriu. Pozorný akvarista se o tento stav určitě nebude snažit.

Překlad: Kersten Opitz
Publikováno: 20.4.2021